豆粕由乳酸菌發(fā)酵加工后，蛋白質(zhì)分子量降低，有機酸含量提高，干物及蛋白質(zhì)消化率提升，因此發(fā)酵豆粕可有效應(yīng)用于水產(chǎn)動物飼料。

　　

　　文/圖 臺灣屏東科技大學(xué) 林鈺鴻  臺灣達邦蛋白公司 劉景平

　　

　　中國水產(chǎn)頻道獨家報道，南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）為目前全球最重要的養(yǎng)殖蝦種，根據(jù)FAO統(tǒng)計資料，南美白對蝦年產(chǎn)量1980年僅8286公噸，快速上升至2011年的287.7萬公噸，增加速度極快。南美白對蝦的養(yǎng)殖，除了成長快速的優(yōu)勢外，重要的是它有別于日本斑節(jié)對蝦（Marsupenaeus japonicus）及草蝦（Penaeus monodon），對于魚粉的依賴性較低，對植物性原料的利用性甚佳，配方設(shè)計上對于蛋白質(zhì)原料選擇更為廣泛。常見魚粉替代性原料包含動物性原料，如肉骨粉、血粉、禽肉粉、羽毛粉等，及植物性原料，包括豆粕、油籽粕、棉籽粕、玉米筋質(zhì)及羽扁豆粉等，其中豆粕價格穩(wěn)定，且營養(yǎng)價值相對較高，廣為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料產(chǎn)業(yè)所使用（El-Sayed，1999）。豆粕使用上仍具許多限制，例如其第一限制氨基酸蛋氨酸（methionine）含量較低，此外，抗?fàn)I養(yǎng)因子，如抗胰蛋白酶（trypsin inhibitor）、血球凝集素（hemagglutinins）、甲狀腺腫原（goitrogens）、抗維生素因子（anti-vitamins）、皂素（saponin）及植酸（phytic acid）等，雖然大部分抗?fàn)I養(yǎng)因子可以藉由原料加工或飼料制程而破壞，但所殘留之抗?fàn)I養(yǎng)因子可能造成水產(chǎn)動物對豆粕之利用性下降（Francis et al.，2001）。

　　

　　亞洲地區(qū)長久以來用微生物發(fā)酵的方式制作傳統(tǒng)黃豆食品，為一有效降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，并提高營養(yǎng)價值之加工方式。以發(fā)酵方式處理豆粕，所得之發(fā)酵豆粕（fermented soybean meal），可降低胰蛋白酶抑制劑、非淀粉類多醣及植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，已廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖動物飼料中，相較于陸上動物的研究報告，水產(chǎn)動物飼料應(yīng)用較少（Zhou et al.，2011）。發(fā)酵豆粕技術(shù)除了可降低抗?fàn)I養(yǎng)因子外，亦可將豆粕蛋白質(zhì)水解為小分子勝肽，以提高動物之利用性。除了將既有原料進行加工、改善其利用性外，利用發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)的微藻類（microalgae），也是一種潛力蛋白質(zhì)來源，例如藍綠藻，培養(yǎng)容易且產(chǎn)量高，蛋白質(zhì)含量高于60%。然而微藻應(yīng)用于水產(chǎn)動物飼料研究甚少，需更多研究數(shù)據(jù)來支持其應(yīng)用。評估各種飼料原料應(yīng)用于南美白對蝦飼料中極為重要，本研究為初步研究，探討南美白對蝦對于兩種新式飼料原料——發(fā)酵豆粕及藍綠藻粉干物及蛋白質(zhì)消化率。

　　

　　

　　實驗對照組飼料（reference diet）組成及測試飼料組成列于表1。測試飼料含70%對照組飼料及30%測試原料，測試原料包括紅魚粉（brown fish meal，Pesquera Diamante，Peru）、脫殼豆粕（大統(tǒng)益公司，臺灣）、發(fā)酵豆粕（達邦蛋白公司，臺灣）、烏賊肝末粉（squid liver meal，Power Omega，Korea）、干貝粉（scallop meal，Japan Biofarm，Japan）、小麥筋粉（wheat gluten，Roquette，F(xiàn)rance）及藍綠藻粉（味丹公司，臺灣），對照組飼料與測試飼料均添加0.5%三氧化二鉻（Cr2O3，Sigma Chemical，USA）。七種測試原料測定其水份、灰份、粗蛋白及粗脂肪含量（AOAC，1995），各成份含量列于表2。飼料配制方式采手工制備，各組飼料于攪拌機中攪拌均勻后，加入適量水，以擠壓方式制粒，制粒后置于20℃烘箱中烘干，再放置于-20℃下凍藏備用。

　　

　　實驗所使用南美白對蝦系購自臺灣屏東民間繁殖場，送至屏東科技大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖系后，于3500L循環(huán)FRP系統(tǒng)馴養(yǎng)，馴養(yǎng)期間喂商業(yè)飼料（統(tǒng)一飼料公司，臺灣）。消化實驗飼養(yǎng)系統(tǒng)為密閉式過濾循環(huán)350升FRP桶槽，水位高約45公分。每缸放置一顆打氣石以鼓風(fēng)機進行打氣。以溫度控制器控制水溫在29±1℃，pH值7.8-8.0，海水鹽度29-32ppt。以定時器控制光照時間，每天光照時間為12小時（0800h-2000h）。循環(huán)水系統(tǒng)包含初級過濾床（過濾棉過濾顆粒懸浮物）、滴濾式過濾槽、生物濾床、蛋白除沫器及殺菌用紫外燈，每2天更換一次初級過濾床的濾棉，以維持水質(zhì)穩(wěn)定。

　　

　　實驗開始時篩選體重約3.95g的白蝦，每缸放置25尾，實驗連同對照組及測試原料組共8個實驗組，每組三重復(fù)。實驗期間每日喂食蝦體濕重6%的飼料，分為兩等份于0900及1700喂食。循環(huán)系統(tǒng)中每一桶槽均搭配糞便收集管，利用水流將桶槽中糞便吸引至收集管的收集網(wǎng)中，再予以收集。各實驗組喂食實驗飼料三天后開始收集糞便，每日第一餐喂食后一小時，清除殘餌及前日糞便，即安裝糞便收集網(wǎng)。每隔1小時收集一次糞便，每日收集5次，持續(xù)收集直至樣品足夠分析。收集后的糞便先以干凈淡水輕輕搖晃沖洗，以去除海水鹽份減少原子吸收光譜儀的干擾。糞便收集后先行凍干，再進行粗蛋白及鉻濃度分析。粗蛋白含量分析與飼料分析相同（AOAC，1995）。鉻濃度分析采用濕式消化法（Furukawa and Tsukahata，1966），樣品灰化后加入70%硝酸（nitric acid，Sigma Chemical）完全分解后，以70%過氯酸（perchloric acid，Sigma Chemical）將鉻原子氧化至六價鉻，再以原子吸收光譜儀（atomic absorption spectrophotometer，ZA-3000，Hitachi Co.，Tokyo，Japan）測定鉻濃度。

　　

　　消化率分別計算表觀干物（ADC-DM）、蛋白質(zhì)（ADC-CP）及原料消化率觀消化效率（ADCi），其公式如下：

　　

　　ADC-DM（%）=100×（%Cr in feed/%Cr in feces）

　　

　　ADC-CP（%）=100×[1-（%Cr in feed/%Cr in feces）×（%CP in feces/%CP in feed）]

　　

　　ADCi=ADCt+[（0.7×Nr）/（0.3×Nt）]（ADCt-ADCr）

　　

　　ADC：表觀消化率（apparent digestibility coefficient）

　　

　　i：測試成分（test ingredient）

　　

　　t：測試日糧（test diet）

　　

　　r： 參考日糧（reference diet）

　　

　　N：營養(yǎng)成分（nutrient composition）

　　

　　實驗數(shù)據(jù)利用SAS/PC軟件（SAS/PC version，SAS Institute，Cary，CA，USA），經(jīng)過變異系數(shù)分析（one-way analysis of variance，ANOVA），測定各試驗組是否有差異（P<0.05），若有顯著差異時，再以鄧肯氏多變域測驗（Duncan’s new multiple range test）做進一步分析（SAS/PC program）。

　　

　　

　　南美白對蝦對七種測試原料的干物及蛋白質(zhì)消化率如表3所示。各原料干物消化率數(shù)據(jù)介于64.79-80.89%，以小麥筋粉最高，紅魚粉、發(fā)酵豆粕、烏賊肝末粉、干貝粉及藍綠藻粉次之，以豆粕最低。蛋白質(zhì)消化率數(shù)據(jù)介于75.64-87.39%，以紅魚粉及小麥筋粉最高，發(fā)酵豆粕及烏賊肝末粉次之，豆粕及干貝粉再次之，以藍綠藻粉最低。

　　

　　當(dāng)檢視豆粕與發(fā)酵豆粕的消化率，可知利用微生物（Lactobacillus spp.）發(fā)酵的豆粕可有效提升干物及蛋白質(zhì)消化率，雖蛋白質(zhì)消化率略低，但干物消化率已與紅魚粉無顯著差異。豆粕發(fā)酵時，藉由微生物所分泌的蛋白酶，能將蛋白質(zhì)做部份水解，而降低其分子量（Kim，2004）。Yan等人（2012）指出以乳酸菌（Lactobacillus spp.）及曲菌（Aspergillus oryzae）對豆粕進行發(fā)酵處理，小豬氮消化率顯著以乳酸菌發(fā)酵組優(yōu)于曲菌發(fā)酵組，原因為乳酸菌對蛋白質(zhì)水解能力優(yōu)于曲菌，能夠產(chǎn)生較多游離氨基酸與分子量較小的勝肽。此外，相較于喂食曲菌發(fā)酵豆粕組，喂食乳酸菌發(fā)酵豆粕的小豬血液有較低尿素氮以及較高白蛋白及肌苷，顯示分子量較小的乳酸菌發(fā)酵豆粕其蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)于分子量較高的曲菌發(fā)酵豆粕，故小豬能更有效吸收與利用發(fā)酵豆粕所提供的蛋白質(zhì)。Yuan等人（2010）指出胭脂魚（Chinese sucker）對豆粕的蛋白質(zhì)消化率（83.2%），其值低于魚粉（91.2%），但豆粕透過發(fā)酵加工即可提高其蛋白質(zhì)消化率至94.0%。

　　

　　本研究所使用的豆粕及發(fā)酵豆粕，委托臺灣中興大學(xué)以高效液相層析儀（HPLC）分析其分子量分布（圖1），可見豆粕分子量主要分布于30-70kDa（占66.7%），經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，發(fā)酵豆粕的分子量主要分布于<30kDa（占75.39%），顯示分子量確實經(jīng)發(fā)酵而大幅下降，因此提高干物及蛋白質(zhì)消化即可預(yù)期。此外，我們研究也發(fā)現(xiàn)分子量小于10kDa的小肽占16.35%，根據(jù)葛（2010）報告指出發(fā)酵豆粕的評判標(biāo)準(zhǔn)，除了外觀、色澤及香味等感官評判外，可采用三氯乙酸沉淀后所測得之可溶性小肽（即分子量小于10kDa的小肽），代表發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解的程度，葛（2010）建議發(fā)酵豆粕應(yīng)至少含有8-12%小肽，本研究所使用之發(fā)酵豆粕即符合此標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)水解后之小分子勝肽，除了被動物消化吸收效率較佳之外，也被認為具有其他之生理作用，例如在人類中，水產(chǎn)品水解勝肽被證實能提高肝臟功能，降低血壓及心血管疾病風(fēng)險等，植物性蛋白質(zhì)水解勝肽也證實具有抗氧化之功效，Lim和Lee（2011）指出羅非魚喂食含Aspergillus oryzae發(fā)酵豆粕飼料，可有效提高魚體內(nèi)抗氧化能力。藉由發(fā)酵工法，除可降低豆粕蛋白質(zhì)分子量外，所得小分子勝肽，若能提供額外機能性，可提高發(fā)酵豆粕的商業(yè)價值。然目前相關(guān)研究甚少，不同魚/蝦種、不同生命期、甚至于所提供的小分子勝肽分子量高低，之間的差異性仍須進一步確認。

　　

　　此外，本研究所使用的發(fā)酵豆粕約含6%有機酸（乳酸）。虹鱒研究指出添加檸檬酸（Vielma et al.，1999；Pandey and Satoh，2008）或乳酸（Pandey and Satoh，2008）雖不影響其成長，但能提升魚體對鐵及磷之利用性。Zhou等人（2009）指出羅非魚飼料中添加丁酸鉀雖不影響成長，然可有效改善腸道菌相，抑制雜菌之生長。Ng等人（2009）則發(fā)現(xiàn)飼料添加丁酸鉀，除能促進羅非魚成長及營養(yǎng)素利用外，亦可提高魚體對病原菌之抵抗。鮭魚喂食1.5%乳酸鈉能提高其成長，并提高腸道蛋白酶活性且抑制雜菌生長（Gislason et al.，1996），此為乳酸的抗菌作用所致。相同魚種亦發(fā)現(xiàn)乳酸除促進成長外，亦可改善鈣與磷之利用與蓄積（Ringo et al.，1994）。乳酸菌發(fā)酵豆粕附帶產(chǎn)生乳酸，亦應(yīng)為改善南美白對蝦之營養(yǎng)素消化率之原因之一。有機酸的其它功能，如促進水產(chǎn)動物成長、營養(yǎng)素利用、腸道菌相等，是否有益于南美白對蝦，值得進一步探討。

　　

　　本研究發(fā)現(xiàn)，藍綠藻雖然干物消化率與紅魚粉無差異，但蛋白質(zhì)消化率顯著低于紅魚粉（表3）。除蛋白消化較差外，藍綠藻粉另一問題為其適口性，我們的實驗過程發(fā)現(xiàn)添加30%藍綠藻粉之測試飼料，造成南美白對蝦對此飼料之適口性下降，消化率試驗期間，每日實際攝食量經(jīng)計算后僅約3.5%，低于其他組別飼料（6%），攝食量較低時，消化率數(shù)值可能受動物體生理狀態(tài)，或有無飽食所影響，因此所得藍綠藻粉消化率仍需進一步研究確認。對此，藍綠藻粉若要應(yīng)用于水產(chǎn)飼料，可能需先解決適口性問題，找出可接受添加量，再考慮其對魚粉的取代性。

　　

　　本研究結(jié)果顯示藉由乳酸菌（Lactobacillus spp.）發(fā)酵加工，可有效降低豆粕的蛋白質(zhì)分子量，提高有機酸含量，提升干物及蛋白質(zhì)消化率，因此發(fā)酵豆粕應(yīng)可有效應(yīng)用于水產(chǎn)動物飼料。藍綠藻因其蛋白質(zhì)消化率低，且適口性差，若要應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中，則須先改善此二問題。