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標(biāo)題: 人工飼料飼養(yǎng)的對蝦腸道菌群和水體細(xì)菌區(qū)系的研究 [打印本頁]
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-8-30 15:58
標(biāo)題: 人工飼料飼養(yǎng)的對蝦腸道菌群和水體細(xì)菌區(qū)系的研究
摘自《熱帶海洋學(xué)報(bào)》
摘要: 對人工飼料飼養(yǎng)的凡納濱對蝦成蝦腸道菌群組成及其水體細(xì)菌區(qū)系組成進(jìn)行了研究。分離純化后的革蘭氏陰性菌鑒定到種的水平。對蝦腸道菌群主要由弧菌、希瓦氏菌屬、嗜氫菌屬、伯克霍爾德氏菌、氣單胞菌、食酸菌和芽孢桿菌組成。水體細(xì)菌區(qū)系主要包括弧菌、希瓦氏菌屬、艾肯菌、無色桿菌和芽孢桿菌。腸道菌群和水體細(xì)菌區(qū)系的優(yōu)勢菌是副溶血弧菌和芽孢桿菌。利用Shannon-Wiener 指數(shù)進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)蝦腸道多樣性指數(shù)(H ) 和均勻度( J ) 高于水體細(xì)菌區(qū)系，而豐度( D) 較低。
關(guān)鍵詞: 蝦腸道菌群; 水體細(xì)菌區(qū)系
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-8-30 16:01
用微生態(tài)學(xué)方法來防治病害發(fā)生、減少環(huán)境污染、增進(jìn)動物健康是未來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的熱點(diǎn)。腸道菌群是微生態(tài)學(xué)中的一個(gè)重要組成部分。腸道菌群對其他動物包括魚蝦類的生長、存活有重要的生理意義[1] 。本文使用Biolog[2]方法對凡納濱對蝦成蝦腸道細(xì)菌區(qū)系組成及其水體細(xì)菌區(qū)系組成進(jìn)行了研究，目的在于為對蝦腸道菌群研究提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-8-30 16:03
1 材料與方法
1.1試驗(yàn)用蝦及飼養(yǎng)管理
凡納濱對蝦蝦苗購于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所海南開發(fā)中心，體重為0.827±0.006g。蝦苗置于14 個(gè)容積為250L 的水池中養(yǎng)殖，每個(gè)水池飼養(yǎng)對蝦25 尾。本試驗(yàn)為全封閉式循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖水體為砂濾循環(huán)人工海水。每天早、中、晚各投喂1 次，飼料為添加了芽孢桿菌制劑的對蝦飼料( 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所生產(chǎn)) 。試驗(yàn)期間水的鹽度為7-11，溫度為28-31℃。飼喂56d 后對蝦平均體重為7.91±0.75g，成活率為95% ±1%。
1.2腸道細(xì)菌分離和計(jì)數(shù)
蝦苗飼養(yǎng)56d 后隨機(jī)在一個(gè)水池中取14 尾，蝦表面用75% 酒精消毒，在無菌操作下取出整條腸道，加入事先稱重過的已滅菌的玻璃勻漿器中稱重。加入少量無菌生理鹽水( 0.85% NaCl) 進(jìn)行勻漿，勻漿后定容至1ml。以勻漿后的樣品為原液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取0.1ml 涂布2216E 平板，28 ℃倒置培養(yǎng)2d 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。分離純化2216E 平板上的單菌落，菌種保存于- 70℃冰箱中。
1.3水體細(xì)菌分離和計(jì)數(shù)
現(xiàn)場用無菌玻璃瓶采集水樣500ml 密封帶回實(shí)驗(yàn)室，然后取1ml 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取01 1ml 涂布2216E 平板，28 ℃倒置培養(yǎng)2d 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。隨機(jī)挑取2216E 平板上各種單菌落劃線作進(jìn)一步純化。菌種保存于- 70 ℃冰箱中。
1.4 Biolg 方法鑒定分析純菌株
按照Biolog( ML3 _ 420) 快速鑒定系統(tǒng)操作程序，對純菌株進(jìn)行革蘭氏染色后將革蘭氏陰性細(xì)菌按照傳統(tǒng)方法[3] 進(jìn)行氧化酶生化鑒定和三糖鐵試驗(yàn)，對其進(jìn)行分類。革蘭氏陽性菌按照Shewan 的海洋異養(yǎng)細(xì)菌檢索表檢索[4]。各類不同的革蘭氏陰性菌培養(yǎng)于Biolog 培養(yǎng)基，根據(jù)不同的濁度要求制備菌懸液，用多孔加樣器接種于96孔GN 微板，每孔150μL，置于合適培養(yǎng)溫度下培4h、16h 后觀察結(jié)果。根據(jù)微板純細(xì)菌代謝指紋情況和Biolog數(shù)據(jù)庫相似度以及位距，得出鑒定結(jié)果(表1)。相似度在0.500-1.000之間，位距在0-5.00 之間，是比較滿意的結(jié)果。
1.5 細(xì)菌多樣性的分析
根據(jù)生態(tài)學(xué)原理，按種的水平分析對蝦腸道細(xì)菌區(qū)系(P) 和水體細(xì)菌區(qū)系(W) 的多樣性，分別用Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)( H ) 、豐度( D) 和均勻度( J ) [4] 表示。計(jì)算公式如下:
H = -∑Pi log2 P 1
D = ( S - 1) / log2N
J = H / log2S
式中Pi 為i 種的個(gè)數(shù)與樣品中總個(gè)數(shù)的比值，S為采樣點(diǎn)中樣品的總種類數(shù)，N 為樣品中細(xì)菌的總數(shù)。
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-8-30 16:04
2 結(jié) 果
2.1 鑒定結(jié)果
純化菌株鑒定結(jié)果見表1。從對蝦腸道菌群和水體細(xì)菌區(qū)系中共分離出71 株細(xì)菌，其中7 株革蘭氏陰性菌因?yàn)椴辉?font face="Times New Roman">Biolog系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中或者是因?yàn)樵谝品N、保種過程中死亡而沒有結(jié)果。對蝦腸道菌群主要由弧菌、希瓦氏菌屬、嗜氫菌屬、伯克霍爾德氏菌、氣單胞菌、食酸菌和芽孢桿菌組成。水體細(xì)菌區(qū)系主要包括弧菌、希瓦氏菌屬、艾肯菌、無色桿菌和芽孢桿菌。
2.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果以及優(yōu)勢種組成
對蝦腸道菌群和水體細(xì)菌區(qū)系的異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)以及優(yōu)勢種組成見表2。
2.3 細(xì)菌聚類分析
對蝦腸道革蘭氏陰性菌和水體革蘭氏陰性菌在24h 記錄的對95種碳源利用的OD 值作為統(tǒng)計(jì)標(biāo)量，利用Biolog系統(tǒng)的Mlclust 程序進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，對蝦腸道菌群與水體細(xì)菌區(qū)系菌株之間的相似性達(dá)到70% 以上，兩者優(yōu)勢菌的相似度高達(dá)90%以上(圖1) 。
2.4 細(xì)菌多樣性
把未鑒定出來的菌株當(dāng)成一個(gè)類群后，分析了對蝦腸道菌群和水體細(xì)菌區(qū)系的細(xì)菌多樣性指數(shù)(表3) 。
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-8-30 16:06
3 討 論
已有研究結(jié)果表明，對蝦的腸道菌群組成受外部環(huán)境影響較大，但弧菌是其腸道常見細(xì)菌。Moriaty[ 6] 發(fā)現(xiàn)在Penaeus japonicus 的養(yǎng)殖水體和腸道中具有相同的細(xì)菌類群。Yasuda 等[7] 報(bào)道，在日本對蝦的蚤狀幼體期弧菌是優(yōu)勢菌屬，養(yǎng)殖126d 以后蝦池中的優(yōu)勢菌是弧菌，但是在沉積物中假單胞菌是優(yōu)勢菌，而日本對蝦的成蝦棲息在沉積物中，因此認(rèn)為在日本對蝦成蝦消化道中的優(yōu)勢菌是假單胞菌。Dempsey等[8] 報(bào)道了在對蝦Penaeus aztecus 和Penaeus setiferus 的胃和后腸中分離鑒定出5 類占優(yōu)勢的細(xì)菌類群，它們是弧菌、產(chǎn)堿桿菌、氣單胞菌、色桿菌和類假單胞菌( 假單胞菌、黃單胞菌和交替單胞菌) 。Wang 等[9]報(bào)道了野生健康中國對蝦腸道細(xì)菌區(qū)系優(yōu)勢菌屬為弧菌和發(fā)光桿菌屬。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，蝦腸道和養(yǎng)殖水體具有相同的優(yōu)勢菌(表2) ; 從細(xì)菌組成看，蝦腸道可培養(yǎng)的細(xì)菌種類比養(yǎng)殖水體多，對蝦腸道中存在部分細(xì)菌種類而養(yǎng)殖水體沒有(表1) 。這表明對蝦腸道菌群與養(yǎng)殖水體有關(guān)，也與飼料有關(guān)。在外部環(huán)境中少量存在的細(xì)菌進(jìn)入對蝦腸道后可以大量繁殖。
在養(yǎng)殖環(huán)境中微生物主要充當(dāng)“消費(fèi)者”的角色，起著分解動植物殘?bào)w、儲存轉(zhuǎn)化養(yǎng)分、降解污染物等作用，從而使得水域環(huán)境得到凈化; 但有害細(xì)菌的增長會導(dǎo)致病害的發(fā)生。通常條件致病菌是海水中的常見菌，有可能隨海水進(jìn)入養(yǎng)殖池中。在人工高密度養(yǎng)殖過程中各種人為因素如水處理過程( 化學(xué)試劑和UV 處理) 會干擾水體中的正常細(xì)菌區(qū)系，加上高密度的養(yǎng)殖、死亡動物以及活餌料的投喂造成高負(fù)荷的有機(jī)環(huán)境，促使池中有害細(xì)菌大量生長繁殖。弧菌被報(bào)道是對蝦的條件致病菌[10] 。
從碳源利用量來看，弧菌可以利用的碳源多達(dá)44種，一旦蝦池環(huán)境受到污染，弧菌就能優(yōu)先利用有機(jī)物而進(jìn)行增殖，若弧菌的增長抑制了其他細(xì)菌的生長，整個(gè)微生態(tài)平衡受到脅迫，生態(tài)功能下降甚至喪失，其蝦池物質(zhì)循環(huán)受到抑制。同時(shí)，當(dāng)水體中弧菌占據(jù)最大優(yōu)勢時(shí)對蝦腸道中也應(yīng)該存在大量弧菌，對蝦受到弧菌的攻擊，生長受到抑制、免疫力低下[11]，再加上外部環(huán)境的脅迫就容易發(fā)病甚至死亡。可見病害的發(fā)生不是特定病原菌引起的，而是環(huán)境污染、對蝦抵抗力弱、微生態(tài)多樣性減少的綜合結(jié)果。本試驗(yàn)中弧菌數(shù)量較多并占據(jù)優(yōu)勢地位，但是其細(xì)菌多樣性指數(shù)也較高，同時(shí)芽孢桿菌的存在可能以某種機(jī)制刺激了對蝦的免疫機(jī)能[12]防御弧菌病原菌的攻擊，因此并沒有爆發(fā)病害。
從碳源利用量來看，對蝦腸道細(xì)菌在純培養(yǎng)時(shí)具有較大的碳源代謝能力。這可能表明對蝦腸道中的細(xì)菌區(qū)系與高等陸生動物腸道中細(xì)菌區(qū)系一樣參與了機(jī)體的消化過程，它們在對蝦的腸道中能夠以高密度存在，并且在相對短但營養(yǎng)豐富的腸道中具有非常大的消化活性。Wang 等[9] 研究也表明，對蝦腸道中某些弧菌很可能具有潛在的助消化能力。
在全封閉式養(yǎng)殖模式下，水體細(xì)菌區(qū)系相對來說與殘餌的關(guān)系更為密切。在本研究中，整個(gè)對蝦腸道中弧菌和芽孢桿菌是優(yōu)勢菌，與水體中的優(yōu)勢菌組成一致。對蝦腸道菌群受水體以及餌料的影響較大。弧菌包括對蝦條件致病菌，不僅是蝦池水體中的正常菌群，還可以在對蝦腸道中大量繁殖，可能具有潛在的助消化能力。可以進(jìn)一步研究從弧菌中篩選有益菌再混合其他有益菌制成一個(gè)多功能群的微小區(qū)系應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，利用弧菌的適合蝦池環(huán)境生長的有利條件來進(jìn)行微生態(tài)調(diào)節(jié)，化有害為有利，從而達(dá)到改善整個(gè)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的效果。
作者: cjlittlepig 時(shí)間: 2012-8-30 16:17
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