苗種培育：魚類精液保存技術(shù)

緣木魚

　　精子運(yùn)動(dòng)所需要的能量來自于原生質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，由于精子的原生質(zhì)極少，能量有限，故精子排入水中被激活后的壽命很短。精子的能量還用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡。魚類精液的保存就是利用降低精子代謝率的方法減少能量的消耗，從而達(dá)到延長(zhǎng)精子壽命的目的。
　　
　　隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展以及雜交育種、優(yōu)良品種的選育與提純復(fù)壯等工作的開展，魚類精液保存技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。魚類精液的保存方法有常溫保存、冷藏保存和冷凍保存。常溫保存和冷藏保存用于短期保存精液，而冷凍或超低溫冷凍則用于長(zhǎng)期保存精液。本文就魚類精液保存技術(shù)做一簡(jiǎn)單闡述。
　　
　　一、常溫保存
　　
　　在常溫條件下，將魚類精子處于等滲環(huán)境中，減少精子用來調(diào)節(jié)滲透壓平衡的能量消耗而延長(zhǎng)精子的壽命。在人工授精操作過程中，用生理鹽水代替淡水，可提高受精率。
　　
　　二、冷藏保存
　　
　　冷藏保存是利用普通冰箱的冷藏室(0~4℃)保存魚類精液，這種方法可保存精液達(dá)數(shù)天至數(shù)十天，如果在精液中加入合適的稀釋液，同時(shí)將冷藏室的問題調(diào)低，保存時(shí)間更長(zhǎng)。冷藏保存時(shí)精子有微弱的代謝需要消耗氧氣，因此在保存時(shí)應(yīng)保持一定的空氣或氧氣。精液冷藏保存時(shí),抗生素是必不可少的。常用的抗生素有：青霉素，5000IU/ml精液；硫酸新霉素，1mg/ml精液；青霉素1000IU+鏈霉素5000IU/ml精液；金霉素0.6mg/ml精液。硫酸新霉素及青霉素+鏈霉素效果較好。此法簡(jiǎn)便、成本低廉，適合在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
　　
　　三、冷凍保存
　　
　　常溫保存和冷藏保存用于短期保存精液，而冷凍或超低溫冷凍則可以長(zhǎng)期保存精液。常用的制冷劑有干冰和液氮等。超低溫下，精子的代謝停滯，精子處于假死狀態(tài)，生命以靜止形式保存。精子冷凍保存的基本技術(shù)路線為：精液的采集→加入稀釋液和抗凍劑→降溫平衡→液氮中長(zhǎng)期保存→解凍復(fù)蘇→活力檢測(cè)。
　　
　　1．稀釋液、抗凍劑
　　
　　稀釋液的配制是魚類精液冷凍保存中關(guān)鍵的一步。由于魚的種的特異性，不同魚類精液冷凍保存對(duì)稀釋液的要求不同，目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。一般認(rèn)為稀釋液的成分在合適的范圍內(nèi)越簡(jiǎn)單越好。已用過的魚類精液保存稀釋液成份主要有：鹽類(如NaHCO3、NaCl、KCl等)、糖類(如葡萄糖、果糖、蔗糖等)、脂類(主要是磷脂)和蛋白質(zhì)(如卵黃、牛奶、小牛血清等)以及其他添加劑(如維生素、抗生素等)。有研究認(rèn)為，海水魚類用由葡萄糖和檸檬酸鈉組成的稀釋液就能獲得良好的冷凍效果。淡水魚類稀釋液則應(yīng)以氯化鈉和氯化鉀為主，加入少量氯化鈣、氯化鎂、碳酸氫鈉和葡萄糖。常用的抗凍劑有甘油、二甲亞砜、乙二醇、乙酰胺和丙二醇等。甘油是海水魚類精液冷凍保存的有效抗凍劑，而二甲亞砜廣泛應(yīng)用于淡水魚類精液的保存。
　
　　2．冷凍方法

　　冷凍方法目前主要使用4種方法：顆粒冷凍法：麥管冷凍法；玻璃安瓿瓶冷凍法；塑料離心管冷凍法。顆粒冷凍法由于冷凍量小、操作較麻煩等原因，目前較少采用。玻璃安瓿瓶法雖然體積較大，效果也不錯(cuò)，但瓶口封口操作比較麻煩，加之在解凍時(shí)，安瓿瓶容易爆裂，故其使用也受到限制。而麥管冷凍法和塑料離心管冷凍法，由于具有冷凍量大、操作簡(jiǎn)便、安全等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于魚類精液冷凍保存和精子庫建立。
　　
　　3．降溫平衡
　　
　　降溫平衡是否需要應(yīng)魚類的種類而異。對(duì)于某一種具體的魚類精子而言，存在著其特異性的最佳冷卻速率，過快或過慢的冷卻速率均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，降低精子的存活率。目前常采用-10℃/min的下降速率，在到達(dá)某一低溫后(-76℃，-150℃等)或直接浸入液氮中，或平衡一段時(shí)間后再浸入液氮中。
　　
　　4．解凍復(fù)蘇

　　解凍復(fù)蘇是精子升溫溶解復(fù)蘇的過程。解凍的關(guān)鍵因素是解凍液和解凍速度。淡水魚類凍精解凍液用體積分?jǐn)?shù)0.65%~0.7%氯化鈉溶液，海水魚類凍精直接用海水即可。解凍方法有室溫自然解凍和快速解凍，比較常用的是在30℃~40℃的水浴中快速解凍。一般而言，如果冷卻過程的速率較快，那么相應(yīng)的復(fù)溫速率也要快。
　　
　　5．活力檢測(cè)
　　
　　解凍后立即在顯微鏡下檢查精子活力：即視野中作直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子的百分比。在原地顫動(dòng)或擺動(dòng)或作微弱曲線運(yùn)動(dòng)的精子無受精能力。
　　
　　隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展以及雜交育種、優(yōu)良品種的選育與提純復(fù)壯等工作的開展，魚類精液保存技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。精液保存的魚類種類由較為單一的品種擴(kuò)大到各常見的海淡水魚類以及一些瀕危、珍惜水生動(dòng)物，保存方法也由較為簡(jiǎn)單的常溫保存、冷藏保存向更為復(fù)雜的冷凍保存逐漸深入。魚類精子保存技術(shù)已經(jīng)日趨完善，己分別建立了鯉科魚類、鮭科魚類、斑馬魚、羅非魚、鯛科魚類及鯔魚等淡、海水魚類精子冷凍保存技術(shù)，并建立了淡水鯉科魚類和一些海水經(jīng)濟(jì)魚類冷凍精子庫。但還存在許多有待解決的問題，如冷凍條件的優(yōu)化（稀釋液的配方、降溫速率、冷凍保存方法和解凍溫度等），冷凍損傷造成精子死亡或活力降低，抗凍劑的洗脫等。